肠道病毒通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品名称：肠道病毒通用染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Name     ：Enterovirus(EV) SYBR qRT-PCR Kit

肠道病毒(Enterovirus，EV)是一种RNA病毒，会引起甲型肝炎，甲型肝炎的潜伏期为15～45天，甲肝病毒散发时以小儿为最多，常表现为食欲减退，厌油，消化不良等。一旦甲肝出现黄疸，出发症状开始明显减轻，胃纳好转，肝大有肿痛，部分病例有脾大，血清胆/红素在病后1-2周内为最高，黄疸可持续2-6周，约1个月左右即消退，因此肠道病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2.根据肠道病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

【试剂组成】

【储存条件及有效期】

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。

【自备试剂】样品RNA

【使用方法】

一、稀释阳性对照（以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。

1.       标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2.      在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

3.      换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

4.      换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品RNA的制备

5.       如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

6.      用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。

三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

7.       如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。

8.      在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.       上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

四、数据处理

10.       如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

       11.     如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。