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过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒(钼酸铵比色法)说明书

发布时间:2023/11/7      点击次数:430

过氧化氢酶(Catalase,CAT)试剂盒(钼酸铵比色法)说明书

微量法100/96


测定意义:                           

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系统中具有重要作用。

 

测定原理:

过氧化氢能氧化MoO42-MoO52-,MoO52-接受氢氧根的电子成键,分子间立即脱水缩合,得到稳定的黄色复合物(H2MoO4·XH2O)n405nm处有强烈吸收峰,其吸光值和过氧化氢浓度成线性关系。测定出体系剩余过氧化氢在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

 

需自备的仪器和用品:

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂组成和配制:

提取液:液体100 mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体10 mL×1瓶,4℃避光保存;

试剂二:液体25 mL×1瓶,常温保存;

试剂三:液体60 mL×1瓶,4℃保存;

 

粗酶液提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

 

测定步骤:

1、   酶标仪预热30min以上,调节波长至405 nm

2、在EP管中加入下列试剂

试剂名称(μL

测定管

空白

样本

10


试剂一

60


混匀,25℃准确反应2 min

试剂二

200


试剂三

530

530

试剂二


200

提取液


10

试剂一


60

混匀,200μL96孔板立即测定A空白A测定,ΔA=A空白-A测定。空白管只需做一管。

 

CAT活性计算:

1、标准曲线:y = 0.09x + 0.0013      R2 = 1      x:体系中过氧化氢浓度变化值(μmol/mL

                                          y:吸光值差值ΔA

2、血清(浆)CAT活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷V÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、组织、细菌或细胞中CAT活力计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反总÷(V×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷W× V÷V样总)÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反总:反应体系总体积,0.8 mLV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,2 minW:样本质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL

 

注意事项:

1、   预实验若发现酶活性过高(A测定<0.1),可用提取液适当稀释样品后测定,并在计算公式中乘以相应稀释倍数

2、   A空白<A测定,一方面可能是酶活性过低,可将反应时间2延长到5min,另一方面可能样本中杂质干扰严重,可将样本稀释5倍左右后测定,并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。


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