k8凯发(中国)

您好!欢迎访问k8凯发(中国)(上海)生命科学有限公司网站!
全国服务咨询热线:

15021281375

当前位置:k8凯发(中国) > 资料下载 > 二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)试剂盒说明书

二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)试剂盒说明书

发布时间:2023/11/7      点击次数:337

二胺氧化酶(Diamine Oxidase,DAO)试剂盒说明书

                                                     微量法100T/48S

 

   :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物(肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等)、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛,其活性与核酸和蛋白合成密切相关,能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。

 

测定原理:

DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢,外源添加过量的辣根过氧化物酶,催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺,在460nm处有特征吸收峰,通过测定该波长吸光度增加速率,计算DAO活性。

 

自备实验用品及仪器:

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

提取液:液体120mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体0.3mL×1支,4℃保存。

试剂二:液体2.5mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体1.2mL×1管,4℃保存。

 

粗酶液提取:

1.        组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2.        细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体:直接测定。

 

测定操作表:

1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至460nm,蒸馏水调零。

2、操作表


对照管

测定管

粗酶液(μL

50

50

提取液(μL

128

108

试剂一(μL

2

2

试剂二(μL

20

20

试剂三(μL


20

混匀,37℃水浴30min,微量石英比色皿/96孔板,蒸馏水调零,测定460nm吸光值ΔA=A测定-A对照。

 

 

酶活性计算公式:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反总÷V×Cpr÷T= 18×A460÷Cpr

2)按样本质量计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/g 鲜重)= ×V反总÷V÷V样总×W÷T= 18×A460÷W

3)按细胞数量计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反总÷V÷V样总×细胞数量)÷T= 18×A460÷细胞数量

 

(4) 按液体体积计算

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反总÷V÷T= 18×A460

ε:氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L/mmol/cmd:比色皿光径,1cmV反总:反应总体积,0.2mLV样:反应中样本体积,0.05mLV样总:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白浓度,mg/mLW:样本质量,gT:反应时间,30min

b. 96孔板测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

DAO活性(nmol/min/mg prot= ×V反总÷V×Cpr÷T= 36×A460÷Cpr

2)按样本质量计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,组织每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/g 鲜重)= ×V反总÷V÷V样总×W÷T= 36×A460÷W

 

3)按细胞数量计算:

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,104个细胞每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/104cell= ×V反总÷V÷V样总×细胞数量)÷T= 36×A460÷细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义:pH7.2,温度为37℃条件下,毫升血清每分钟催化产生1nmol H2O2所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性(nmol/min/mL= ×V反总÷V÷T= 36×A460

ε:氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数:7.5 L /mmol/cmd:96孔板光径,0.5cmV反总:反应总体积,0.2mLV样:反应中样本体积,0.05mLV样总:加入提取液体积,1mLCpr:样本蛋白浓度,mg/mLW:样本质量,gT:反应时间,30min

 

注意事项:

1、如果OD值小于0.01,适当加大提取用样本量;OD值大于0.8,粗酶液可适当稀释,或者减少提取用样本量。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。


文件下载    图片下载    
k8凯发(中国)(上海)生命科学有限公司
地址:金大公路8218号1幢
邮箱:1431486511@qq.com
传真:
关注k8凯发(中国)
欢迎您关注k8凯发(中国)的微信公众号了解更多信息:
欢迎您关注k8凯发(中国)的微信公众号
了解更多信息