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H2S含量测定试剂盒说明书

发布时间:2023/10/31      点击次数:296

H2S含量测定试剂盒说明书

                                         微量法100T/96S

 

 

    意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

H2S是一种新型气态信号分子,存在于脑内的神经递质,生理浓度的H2S对神经系统海马的长时程增强功能具有重要的调节作用,并对自发性高血压、出血性休克及肝硬化等疾病的过程发挥着重要的病理生理效应。

 

测定原理:

H2S与醋酸锌、N, N-二甲基对苯二胺和硫酸铁铵等反应生成亚甲基蓝,亚甲基蓝在665nm处有最大吸收峰,通过测定其吸光值可计算H2S含量。

 

自备实验用品及仪器:

天平、低温离心机、酶标仪、96孔板、蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体25mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体16mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体8mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂四:液体8mL×1瓶,4℃保存。

试剂五:液体1.5mL×1管,4℃避光保存。

 

样品处理:

1.        组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.        细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.        血清(浆):直接测定。

 

操作表:

1、   酶标仪预热30min,调节波长至665nm

2、   操作表


空白管

测定管

样品(μL


150

H2OμL

150


试剂一(μL

150

150

充分震荡混匀

试剂二(μL

150

150

10000g,4℃,离心10min,去上清,留沉淀

H2OμL

150

150

10000g,4℃,离心10min,去上清,留沉淀

试剂一(μL

75

75

试剂三(μL

75

75

充分震荡混匀

试剂四(μL

75

75

10000rpm,4℃,离心10min,吸取200μL上清96孔板中

试剂五(μL

10

10

混匀,25静置5min,测定665nm吸光值,记为A测定和A空白,ΔA=A测定-A空白。

 

H2S含量计算公式:

96孔板测定的计算公式如下

标准曲线回归方程为:y = 0.0022x,R2 = 0.9988

1)组织样品

a.按照蛋白浓度计算

H2Snmol/mg prot=×V反总÷(V样×Cpr)=681.8×ΔA÷Cpr

 

b.按照样本重量计算

H2Snmol/g 鲜重)=×V反总÷(V÷V样总×W)= 681.8×ΔA÷W

(3) 细胞

H2Snmol/104 cell=×V反总÷V÷V样总×细胞数量(万个)=681.8×ΔA÷细胞数量(万个)

 

2)液体样品H2Snmol/mL=×V反总÷V= 681.8×ΔA

V反总:反应总体积,0.225mLV样:反应中样品体积,0.15mLV样总:加入提取液体积,1mLW:样品质量,gCpr:蛋白浓度,mg/mL

 

注意事项:

Z低检出限为1nmol/mL


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