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    土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性测定试剂盒说明书

    发布时间:2023/9/20      点击次数:289

    土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性测定试剂盒说明书

                                                微量法 100/96

     

        意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

    测定意义:

    GLSEC 3.5.1.2存在于高等动物和某些细菌以及植物根中,催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代谢中具有重要调控作用,尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。

     

    测定原理:

    S-GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。

    需自备仪器和用品:

    台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、甲苯、冰和双蒸水。

     

    试剂组成和配制:

    试剂一×1瓶,15 mL,4 ℃保存;

    试剂二×1瓶,40 mL,4 ℃保存;

    试剂三×1瓶,60 mL,常温保存;

    试剂四×1瓶,5 mL,常温保存;

    试剂五×1瓶,3 mL,常温保存;

    试剂六×1瓶,3 mL,常温避光保存。

     

    测定步骤:

    1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至420nm,蒸馏水调零。

    2、样品测定(在EP管中加入下列试剂):

    试剂名称(uL

    测定管

    对照管

    样本

    0.1


    甲苯

    25

    25

    振荡混匀,室温放置15min

    试剂一

    100

    100

    试剂二

    400

    400

    混匀,37℃水浴2 小时

    试剂三

    525

    525

    混匀,8000 g,25℃离心10 min;取上清液,依次加入下列试剂

    上清液

    130

    130

    试剂四

    30

    30

    试剂五

    20

    20

    试剂六

    20

    20

    混匀,室温静置15min,420nm处读取测定管和对照管吸光值,

    计算ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

     

    注意:试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。

     

    酶活性计算:

    a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

    标准条件下测定的回归方程为y = 3.8488x+0.0057x为标准品浓度(μmol/mL),y吸光值A

    单位定义:每g土样min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

     S-GLSnmol/min/g 土样)=(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反总÷W÷T=2.27×(ΔA -0.0057)÷W

    V反总:反应体系总体积:1.05mLT:反应时间,2h=120minW:样本质量,g; 1000,μmolnmol换算系数。

     

    b.96孔板测定的计算公式如下

    标准条件下测定的回归方程为y = 1.9244x+0.0057x为标准品浓度(μmol/mL),y吸光值A

    单位定义:每g土样min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

     S-GLSnmol/min/g 土样)=(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷W÷T=4.55×(ΔA -0.0057)÷W

    V反总:反应体系总体积:0.525mLT:反应时间,2h=120minW:样本质量,g; 1000,μmolnmol换算系数。



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