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U87MG 人脑星形胶质母细胞瘤培养说明书

发布时间:2023/8/29      点击次数:769

人脑星形胶质母细胞瘤

U-87MG

细胞介绍

该细胞系由PontenJ等建立,源于恶性神经胶质瘤。裸鼠皮下接种可成瘤。

细胞特性

1)  来源:神经胶质瘤

2)  形态:上皮样,贴壁细胞

3)  含量:>1x106 细胞数

4)  规格:T25瓶或者1mL冻存管包装

    5) 用途:仅供科研使用。

运输和保存:干冰运输及复苏好存活细胞:(11mL冻存管包装干冰运输,收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏,若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染,请立即与k8凯发(中国)联系。(2T25瓶复苏的存活细胞常温发货,收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理:

1)收到细胞后,75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h,若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染,请拍照后及时联系k8凯发(中国)。

2)请在45X显微镜下确认细胞状态,同时给刚收到的细胞拍照(10×,20×)各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存,作为售后时收到时细胞状态的依据。

3)贴壁细胞:细胞在37℃培养箱中放置2-3h,显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况,有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下,可去除培养瓶中灌液培养基(若有未贴壁的细胞需要离心回收,重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完6-8mL,放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上,可以对细胞进行传代处理。传代过程中,若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4备注:运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞,请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完培来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1:2传代    

                 

一.培养基及培养冻存条件准备:

1) 准备MEM养基;优质胎牛血清,10%2mM L-谷氨酰胺;NEAA  1% 双抗,1%

注意事项:培养细胞的过程中细胞会发生堆叠和松散贴壁的细胞团这是正常的。需要2-3天对细胞进行一次换液以保证细胞的正常生长。该细胞贴壁较慢,复苏细胞后48h 内尽量不要移动细胞让细胞达到最佳的贴壁状态。生长过程中会悬浮细胞出现,在换液和传代过程中需要离心回收悬浮的细胞。丢弃悬浮的细胞会使细胞的密度变低,这个细胞在培养过程中不会达到100%的融合。细胞生长过密会引起贴壁的细胞变成悬浮的状态。明胶或多聚赖氨酸包被的培养瓶可以使细胞更好的贴壁

2) 培养条件: 气相:空气,95%;二氧化碳,5% 温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%

3) 冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。

二. 二.细胞处理:

1)冻存细胞的复苏:

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完培的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2 细胞传代:如果细胞密度达70%-90%,即可进行传代培养。

该细胞轻微贴壁和悬浮培养的细胞,传代可以参考以下方法:

1. 收集:将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T251-2mL,T752-3mL)置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4ml10%FBS的培养基来终止消化。

3. 将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min,弃去上清,补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行

3 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例;

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中,可使用血球计数板计数,来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min,去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ,按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80度冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

注意事项:

1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性,必须在二级生物安全台内操作,并请注意防护,所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意:冻存管浸没在液氮中会泄漏,并会慢慢充满液氮。解冻时,液氮转化成气相可能导致容器爆炸或用危险力吹掉其盖子,从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。



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