k8凯发(中国)

您好!欢迎访问k8凯发(中国)(上海)生命科学有限公司网站!
全国服务咨询热线:

15021281375

当前位置:k8凯发(中国) > 资料下载 > α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

发布时间:2023/6/11      点击次数:868

α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性测定试剂盒说明书

                                        微量法100/96

 

   意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

α-KGDHEC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A

 

测定原理:

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

 

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1瓶,-20保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20保存;

试剂四:液体20mL×1瓶,4保存;

试剂五:粉剂×1瓶,-20保存;

试剂六:粉剂×1支,-20保存;

 

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、   称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、   将匀浆600g,4离心5min

3、   弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4离心10min

4、   上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH(此步可选做)。

5、   在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体α-KGDH活性测定。

 

测定步骤:

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、  样本测定

1)在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min现配现用

2)在试剂六中加入1mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融

3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五,混匀,立即记录340nm20s时的吸光值A1 2min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1

 

α-KGDH活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDHnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=0.65×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 Lε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

 

b.96孔板测定的计算公式如下

1 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:mg组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

2 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性nmol/min/g 鲜重)[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(W× V÷V样总) ÷T=650×ΔA÷W

3 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(nmol/min/104 cell[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(500×V÷V样总) ÷T=1.3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 Lε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:96孔板光径,0.5cmV样:加入样本体积,0.01 mLV样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500万。


文件下载    图片下载    
k8凯发(中国)(上海)生命科学有限公司
地址:金大公路8218号1幢
邮箱:1431486511@qq.com
传真:
关注k8凯发(中国)
欢迎您关注k8凯发(中国)的微信公众号了解更多信息:
欢迎您关注k8凯发(中国)的微信公众号
了解更多信息