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乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)试剂盒说明书

发布时间:2023/5/12      点击次数:401

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)试剂盒说明书

                                          微量法100/48

 

   :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

 

测定原理:

ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC活性。

 

需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 

试剂的组成:

提取液:100mL×1瓶,4保存;

试剂一:10mL×1瓶, 4保存;

试剂二:粉剂×1瓶,4保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20保存;

试剂四:粉剂×1 , 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4可保存一周。

试剂五:粉剂×1, 4保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后4可保存一周。

试剂六:液体 25mL×1 瓶,室温保存。

试剂七:10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4保存。

 

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

 

测定步骤:

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。

2、   酶促反应试剂的配制和预热:在试剂二瓶中加入2.5mL试剂一,充分溶解混匀;在试剂三瓶中加入2mL蒸馏水,充分溶解混匀;将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)25(其它物种)预热10分钟。

3、定磷试剂的配制:按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂

              应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

 

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂七20倍稀释,即取 0.5mL试剂七9.5蒸馏水,充分混匀。

5、酶促反应

试剂名称μL

对照管

测定管

试剂一

90


试剂二


50

试剂三


40

样本

10

10

37(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,90水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25离心5min,取上清

6、定磷


标准管

空白管

对照管

测定管

0.5μmol/mL标准磷应用液

20




蒸馏水


20



上清液



20

20

定磷试剂

180

180

180

180

混匀,37(哺乳动物)或25(其它物种)保温30min,冷却至室温,在 660nm处,蒸馏水调零,记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。

注意:若测定管吸光值大于2,将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定,使吸光值小于2,可提高检测灵敏度,计算公式中乘以相应稀释倍数。

 

ACC活性计算:

1、按组织蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管

(V×Cpr)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

定义:每小时每g组织产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (μmol/h /g鲜重)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V÷

(W× V÷V样总)÷T=10×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3、   按细菌或细胞密度计算:

定义:每小时每500万细菌或细胞产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (U/104 cell)=(C标准管×V)×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V÷

(500× V÷V样总)÷T=0.02×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C标准管:标准管浓度,0.5μmol/mLV总:酶促反应总体积,0.1mLV样:加入样本体积,0.01mL V样总:加入提取液体积,1mLT:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本鲜重,g500:细菌或细胞总数,500万。


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