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吲哚乙酸氧化酶活性测定试剂盒说明书

发布时间:2023/5/7      点击次数:898

   :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

吲哚乙酸(IAA)在吲哚乙酸氧化酶的作用下,被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小,对调节体内吲哚乙酸的水平,起着重要的作用,而影响植物的生长。

 

测定原理:
在无机酸存在情况下,吲哚乙酸能与FeCl3作用,生成红色螯合物,该物质在530nm处有最大吸收峰,酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

 

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、1.5mL离心管、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

 

试剂组成和配制:

试剂一:液体120mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体10mL×1瓶,4℃保存。

试剂三:液体10mL×1瓶,4℃保存。

试剂四:液体10mL×1瓶,4保存。

试剂五:液体2mL×1瓶,4避光保存。

试剂六:液体50mL×1瓶,4保存。临用前吸取1mL试剂五加入试剂六中混匀,待用,避光保存

 

粗酶液提取:

1.        组织:按照组织质量(g:试剂一体积(mL)1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4离心10min,取上清置冰上待测。

2.        细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4,离心10min,取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体:直接测定。

 

测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到530 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二、试剂三、试剂四置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中保温20min

3. 1.5mL EP管若干,按操作依次加入试剂,操作表如下:


标准管

测定管

试剂二(μL

20

20

试剂三(μL

20

20

试剂四(μL

40

40

样本上清液(μL

0

20

试剂一(μL

120

100

充分混匀后置于30°恒温水浴中,保温反应30min

实际六(μL

400

400

充分混匀,置于30℃黑暗水浴保温显色30min。取200μL显色后呈红色的反应液于微量玻璃比色皿/96孔板中,用分光光度计或酶标仪中测定波长530nmOD值,标准管记为A1,测定管记为A2

注意:标准管只需做一次

 

IAA氧化酶活性计算公式:

a.        使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

IAA标准曲线公式:y = 1.334x + 0.025  R2 = 0.998 xIAA浓度,mmol /Ly为吸光值)

(1)         按蛋白浓度计算

酶活定义:从开始时加入的IAA量减去酶作用后残留的IAA含量,即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 Uμmol/h/mg prot=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷V×Cpr÷T

=1.5×A1-A2÷Cpr

(2)         按样本鲜重计算

酶活定义:以每g样本在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/g 鲜重)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V样总×W) ÷T

=1.5×A1-A2÷W

(3)         按细胞数量计算

酶活定义:以每1万个细胞在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 

Uμmol/h/104 cell=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V样总×W) ÷T

=1.5×A1-A2÷细胞数量

(4)         按液体体积计算

酶活定义:以每mL酶液在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/mL=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V÷(V÷V样总) ÷T

=1.5×A1-A2

V样总:上清液总体积,1mLV样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mLCpr:上清液蛋白质浓度,mg/mLW:样品质量,g,T:反应时间,0.5h

 

b.使用96孔板测定的计算公式如下

IAA标准曲线公式:y = 0.667x + 0.025  R2 = 0.998 xIAA浓度,mmol /Ly为吸光值)

1)按蛋白浓度计算

酶活定义:从开始时加入的IAA量减去酶作用后残留的IAA含量,即得被酶所催化的IAA含量。以每mg酶蛋白在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 Uμmol/h/mg prot=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷V×Cpr÷T

=3×A1-A2÷Cpr

2)按样本鲜重计算

酶活定义:以每g样本在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/g 鲜重)=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V样总×W) ÷T

=3×A1-A2÷W

3)按细胞数量计算

酶活定义:以每1万个细胞在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

 

Uμmol/h/104 cell=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V样总×W) ÷T

=3×A1-A2÷细胞数量

4)按液体体积计算

酶活定义:以每mL酶液在1h内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

Uμmol/h/mL=[(A1-0.025) ÷0.667-(A2-0.025) ÷0.667] ×V÷(V÷V样总) ÷T

=3×A1-A2

V样总:上清液总体积,1mLV样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mLCpr:上清液蛋白质浓度,mg/mLW:样品质量,g,T:反应时间,0.5h

 

注意事项:

Z低检出限为0.01μmol/mL


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