巴贝斯虫(Bab)核酸检测试剂盒说明书
通用名称:巴贝斯虫(Bab)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)
Name:Babesia Canis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
巴贝斯虫病是一种蜱传性的血液原虫病,该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起,其临床特征为发热、精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等,对犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]
本试剂盒适用于检测血液中的巴贝斯虫,用于巴贝斯虫感染的辅助诊断。
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对巴贝斯虫基因组特异性引物,结合一条特异性探针,用荧光 PCR 技术对巴贝斯虫基因组的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。
包装规格 | 50T/盒 |
Bab 反应液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
Bab 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
无菌注射器抽取血液 3~5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 2~8℃冰袋运输, 严禁反复冻融。
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入
1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;咽拭子样品直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
推荐采用k8凯发(中国)(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按 照试剂说明书进行操作。
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满
10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | Bab 反应液 | 酶液 |
用量(样本数为 N) | 20μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,21uL/管。
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及 Threshold 的
Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38,且曲线有明显的增长曲线, 判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
1. 所有操作严格按照说明书进行;
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,*混匀并短暂离心;
3. 反应液应避光保存;
4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
[1] 李蓓蓓.犬巴贝斯虫病的诊断与预防[J].今日畜牧兽医,2019,35(03):99.
[2] 陕西省部分宠物医院犬巴贝斯虫病流行情况及病原鉴定[D]. 唐欢.西北农林科技大学,2019.
蜱传性的血液原虫病,该病由寄生于红细胞内的多种巴贝斯虫引起,其临床特征为发热、 精神沉郁、嗜睡、黄疸、贫血、血红蛋白尿、呕吐、呼吸困难等,对犬的健康造成了巨大的危害。[1-2]
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